Laboratorijska dijagnostika

Laboratorijska dijagnostika leukemija  zasniva se na proučavanju leukemijskih ćelija  u kostnoj srži i perifernoj krvi i ima tri osnovna cilja. To su:

• postavljanje dijagnoze
• klasifikacija leukemija
• procena efikasnosti lečenja

Cilj ovako kompleksnog pristupa  dijagnostici je da se precizno utvrdi tip leukemije i da se na osnovu toga odabere odgovarajući oblik lečenja.

POSTAVLJANJE DIJAGNOZE

Prvi korak pri postavljanju dijagnoze je prepoznavanje leukemijskih ćelija (blasta), odnosno njihovo  razlikovanje od normalnih   ćelija krvi (ćelija hematopoeze). Od presudnog značaja je ispitivanje kostne srži pošto kod oko 20% bolesnika blasti nisu prisutni u perifernoj krvi  ili se njihov  izgled u perifernoj krvi i kostnoj srži razlikuje. Kriterijumi za postavljanje dijagnoze akutne leukemije su: prisustvo ³25% limfoblasta u kostnoj srži kod akutnih limfoblastnih leukemija (ALL), ili ³20% mijeloblasta kod akutnih mijeloblastnih leukemija (AML). Uobičajeno je da se kostna srž dobija postupkom aspiracije   koju je u odabranim slučajevima neophodno dopuniti biopsijom.

Kostna srž predstavlja meko tkivo koje se nalazi u šupljim delovima većine kostiju i ima ulogu u stvaranju ćelija krvi.

Aspiracija  je usisavanje  male količine tečnosti iz kostne srži uz pomoć specijalne igle, a biopsija je uzimanje malog komada kostne srži uz pomoć specijalne igle za biopsiju.  Materijal dobijen aspiracijom obezbeđuje nam ćelije za procenu njihovog izgleda, dok je uzorak biopsije pogodan za procenu  celularnosti, kao i rasprostranjenosti oštećenja  u kostnoj srži, a služi nam i kao zamena za aspirat u slučajevima kada ga nije moguće dobiti u dovoljnoj količini  (napr. kada  se u kostnoj srži nalazi izrazito mali broj ćelija). 

Jedna od dijagnostičkih procedura je i pregled  cerebrospinalne tečnosti koji treba da ukaže  na stepen rasprostranjenosti leukemije u organizmu (da li je leukemija zahvatila nervni sistem). Tečnost se dobija iz kičmenog kanala, specijalnom iglom, a procedura se naziva lumbalna punkcija. U laboratoriji se vrše citološka (mikroskopski pregled ćelija i prepoznavanje leukemijskih ćelija ukoliko su prisutne) i biohemijska ispitivanja.

KLASIFIKACIJA AKUTNIH LEUKEMIJA

U cilju klasifikacije akutnih leukemija  primenjuje se istovremeno nekoliko različitih tehnika za ispitivanje leukemijskih celija, kao što su ispitivanje: 

• izgleda  (citomorfologija) i hemijskih reakcija (citohemija) 
• imunoloških osobina (imunofenotipizacija) 

• promena koje se dešavaju na nivou hromozoma (metode citogenetike) i gena (metode molekularne genetike) 

Na osnovu navedenih ispitivanja Svetska zdravstvena organizacija (WHO) je  formirala klasifikaciju leukemija i hematoloških tumora.   U njenoj izradi je učestvovalo  više od 50 patologa iz celog sveta.  Prihvaćena je kao standard i priznali su je   stručnjaci koji su formirali sve dotadašnje  najznačajnije klasifikacije.  U ovoj najnovijoj klasifikaciji   hematološke maligne bolesti primarno su grupisana prema vrsti ćelija krvi od kojih su nastale, a specifične hromozomske promene predstavljaju jedan od najvažnijih dijagnostičkih parametara za određivanje tipa bolesti.

Ispitivanje izgleda i hemijskih reakcija

Prepoznavanje leukemijskih ćelija, odnosno ispitivanje njihovog izgleda,  vrši se mikroskopskim pregledom razmaza aspirata kostne srži i periferne krvi koji su obojeni tehnikom May-Grünwald Giemsa (MGG). Ispitivanje hemijskih reakcija vrši se specijalnim tehnikama bojenja od kojih su najznacajnija bojenja na  mijeloperoksidazu (MPO) ili SudanBB (SBB)  i nespecifičnu esterazu, odnosno alfa naftil acetat esterazu (ANAE).  Ispitivanjem izgleda i hemijskih reakcija se postiže jedna od klasifikacija -   FAB (Francuska-Americka-Britanska kooperativna grupa) klasifikacija akutnih leukemija   na tri podtipa akutnih limfoblastnih leukemija (L1, L2 i L3) i osam podtipova akutnih mijeloblastnih leukemija (M0, M1, M2, i M3 sa granulocitnom diferencijacijom, M4 i M5 sa monoblastnom diferencijacijom, M6 - eritroleukemija - porekla crvenih krvnih zrnaca,  i M7 - megakarioblastna leukemija - porekla krvnih pločica).  Izgled ćelija i hemijske reakcije koje se odigravaju u njima   ne mogu sa sigurnošću da nam potvrde  kojoj vrsti ćelija (ćelijskoj lozi) pripadaju leukemijske ćelije, pa je neophodno:

Ispitivanje imunofenotipa

Imunofenotipizacija ili  ispitivanje imunoloških osobina leukemijskih ćelija,  tj. dokazivanje  imunoloških markera na površini ili unutar ćelija,  predstavlja najbitniju komponentu dijagnostičkog postupka kojim se postiže precizno tipiziranje leukemijskih ćelija. 
Ispitivanje se vrši   savremenom tehnologijom - metodom protočne citometrije,koja uz pomoć lasera i moćnih kompjuterskih softvera velikom brzinom analizira leukemijske ćelije  koje su prethodno posebnim postupkom obeležene fluorescentnim bojama.  Na ovaj način  se postiže druga vrsta klasifikacije -  EGIL (Evropska grupa za imunolosku klasifikaciju akutnih leukemija) klasifikacija akutnih leukemija na:  limfoblastne (ALL), mijeloblastne (AML), bifenotipske  i nediferencirane akutne leukemije.  ALL se, na osnovu prisutnih ćelijskih markera dele na dve velike grupe: one koje su  porekla B limfocitne  (B-ALL) i one koje su porekla T limfocitne celijske loze (T-ALL). Svaka od tih grupa je, prema stepenu zrelosti leukemijskih celija, podeljena na po cetiri podtipa. Kao posebna kategorija navodi se ALL sa  ispoljavanjem jednog ili dva mijeloidna markera. U grupi AML se razlikuje šest podtipova:  mijelomonocitna, eritroidna, megakariocitna, slabo diferencirana mijeloidna, TdT+ AML i AML sa ispoljavanjem jednog ili dva limfoidna markera. Manje učestale grupe, kao što su nediferencirana ili bifenotipske  akutne leukemije,  dijagnostikuju se prema  posebnim kriterijumima, odnosno sistemu bodovanja prisutnih ćelijskih antigena. 

Metode citogenetike i molekularne genetike
Dokazano je da promene na hromozomima (naslednom materijalu) dovode do transformacije normalnih ćelija krvne loze u maligne, “leukemijske” ćelije. Promene na hromozomima, strukturne ili numeričke, su povezane sa određenim tipom leukemije i imaju prognostički značaj. Specifične hromozomske promene, koje su povezane sa malignitetima objavljene su 2007. godine u “Database of Chromosome Aberrations in Cancer”, autora Mitelman-a. Najčešće hromozomske aberacije koje uzrokuju nastanak leukemija kod dece  prikazane su u tabeli 2.
Tabela 2.  Najčešće hromozomske aberacije u leukemijama kod dece

B-ALL - B akutna limfoblastna leukemija, T-ALL - T akutna limfoblastna leukemija, AML - akutna mijeloidna leukemija, CML - hronična mijeloidna leukemija

U cilju postavljanja što preciznije dijagnoze kod leukemija, često je neophodno koristiti veći broj tehnika savremene genetike: citogenetiku, fluorescentnu in situ hibridizacija (FISH), lančano umnožavanje molekula DNK (PCR) ili kvantitativno umnožavanje molekula DNK (RQ-PCR).

Klasična citogenetika, analizom na svetlosnom mikroskopu, omogućava otkrivanje krupnih strukturnih i numeričkih hromozomskih promena u kostnoj srži pacijenata obolelih od leukemija.
Metode molekularne genetike omogućavaju otkrivanje sitnijih promena na genima, koje nije moguće videti pod mikroskopom. Prednost molekularnih metoda je njihova visoka osetljivost, koja omogućava detekciju jedne maligne ćelije u čak milion normalnih ćelija. Na ovaj način moguće je otkriti prisustvo retkih malignih klonova, kao i praćenje minimalne rezidualne bolesti (MRD).
RT-PCR metodom se kod pacijenata obolelih od leukemije ciljano ispituje prisustvo određenih promena na genima, kao što su translokacije: t(9;22), t(4;11), t(12;21), t(1;19), t (15;17), t(8;21).
Kvantitativna PCR analiza, upotrebom “real time” PCR aparata, obezbeđuje veću osetljivost analize i procenu odgovora bolesnika na lečenje, kao i precizno doziranje terapije kod bolesnika pozitivnih za BCR-ABL rearanžman.
STR-PCR metoda omogućava praćenje pacijenata nakon transplantacije kostne srži, sa ciljem da se na vreme otkrije odbacivanje kalema ili pojava recidiva bolesti. Ovom metodom se pre transplantacije odrede razlike na nivou naslednog materijala između davaoca i primaoca, a zatim se ove razlike prate u određenim vremenskim intervalima nakon transplantacije kostne srži.
Zahvaljujući razvoju tehnika citogenetike i molekularne genetike sve su veći uspesi u lečenju pacijenata obolelih od maligniteta. Metode citogenetike i molekularne genetike omogućavaju potvrdu dijagnoze, svrstavaju pacijente u određenu grupu rizika (standardni, srednji ili visoki), pomažu u izboru i doziranju terapije. Takođe, nova saznanja iz oblasti genetike omogućavaju razvoj novih, manje toksičnih pristupa u lečenju pacijenata obolelih od leukemije.

PROCENA EFIKASNOSTI LEČENJA
Efikasnost lečenja AL procenjuje se praćenjem  brzine  nestajanja leukemijskih ćelija iz kostne srži tokom lečenja. Zahvaljujući velikom napretku u dijagnostici hematoloških malignih bolesti danas je moguće   pouzdano  prepoznavanje  veoma malog broja malignih ćelija, poznatog kao minimalna rezidualna bolest (MRB ili MRD u literaturi na engleskom jeziku).
Za kontrolu MRB postoji nekoliko tehnika koje se razlikuju prema osetljivosti i brzini izvođenja, kao i ceni. Osetljivost  se kreće od mogućnosti otkrivanja 1 leukemijske ćelije na 100 normalnih kod mikroskopskog (citološkog) pregleda kostne srži, kao i  pregleda koji se vrši metodama citogenetike. Zatim 1 na 10 000 normalnih ćelija kod procene metodom protočne citometrije,  i 1 na  milion normalnih ćelija kod procene na nivou gena.

Remisija, odnosno MRB se za sada procenjuju mikroskopskim pregledom kostne srži.  Rađene su studije u više svetskih centara i utvrđeno je da  osetljive metode za kontrolu MRB  kod ALL dečijeg doba daju pouzdanije informacije o broju zaostalih leukemijskih ćelija, kao i o prognozi bolesti.  To je, pre svega značajno za procenu ranog odgovora na lečenje i u budućnosti će se verovatno koristiti za modifikovanje lečenja:  povećanje  ili smanjenje intenziteta.   Dve metode su se posebno istakle kao  pogodne  za procenu MRB kod ALL. To su: protočna citometrija koja otkriva imunofenotip  (imunološke osobine leukemijskih ćelija) udružen sa leukemijom, i  PCR metoda   koja otkriva  MRB na nivou gena. Prednost se daje   protočnoj citometriji koja je prihvatljivija  za rutinske laboratorije.  Relativno je jeftina,  primenljiva kod  > 95% bolesnika,  ima osobine pouzdane metode za procenu MRB i rezultati su slični PCR metodi  koja otkriva  MRB na nivou gena.     

Leukemije  se dijagnostikuju na isti način, prema gore navedenim postupcima tj. svetskim standardima,  kod sve obolele dece na teritoriji Srbije, Crne Gore i Republike Srpske, a ostvarena je i dobro organizovana saradnja između centara koji se bave lečenjem. To su: dva centra u Beogradu, i po jedan u Novom Sada, Nišu  i Banja Luci.

Naša Nacionalna grupa za akutne leukemije dečijeg doba, koja radi u okviru Intersekcijskog odbora za dečiju hematologiju i onkologiju Srpskog lekarskog društva,  je član i aktivan učesnik  internacionalne grupe (I-BFM grupa) za leukemije dečijeg doba. U okviru saradnje sa I-BFM grupom   započećemo praćenje MRB osetljivom metodom protočne citometrije i kod naše obolele dece, najverovatnije  krajem 2009.godine.

Autor teksta:
Prim dr Bojana Slavković
Institut za zdravstvenu zaštitu majke i deteta Srbije „Dr Vukan Čupić“, Beograd